概述

抗體偶聯(lián)藥物（ADC）是一類通過將細胞毒性小分子化合物共價連接至單克隆抗體而成的藥物，可增強傳統(tǒng)抗腫瘤小分子藥物的靶向性并降低毒副作用。由于ADC結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性及體內(nèi)藥物抗體比（DAR）的動態(tài)變化，其生物分析面臨巨大挑戰(zhàn)。藥代動力學(xué)（PK）是解讀藥物療效與安全性的物質(zhì)基礎(chǔ)，其重要性不言而喻。另一大挑戰(zhàn)是抗治療藥物抗體（ATA）的評估，因其可能對藥代動力學(xué)研究結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。

生物分析的關(guān)鍵考量

●ADC的異質(zhì)性

ADC實為混合物：其抗體通過連接子與小分子藥物共價結(jié)合，可連接于抗體賴氨酸側(cè)鏈、鏈間二硫鍵還原產(chǎn)生的巰基，或抗體特定位點引入的工程化半胱氨酸1?3。

●體內(nèi)DAR值的動態(tài)變化

ADC在血漿中理論上穩(wěn)定，但在特殊條件下連接子仍可能斷裂，導(dǎo)致小分子藥物解離。這種解離會改變DAR值或產(chǎn)生新的DAR分布。研究表明，ADC的清除率隨DAR值升高而增加?。

●待測物的選擇

小分子藥物與蛋白藥物的暴露-效應(yīng)關(guān)系（ER）可通過檢測原藥獲知。然而ADC同時包含抗體與小分子藥物組分，且體內(nèi)DAR值動態(tài)變化、臨床數(shù)據(jù)有限，因此難以確定何種物質(zhì)影響ER。通常在ADC開發(fā)早期，會盡可能多地檢測各類物質(zhì)以全面了解其PK特征，一般包括：總抗體、ADC、游離小分子藥物。此外，ADC進入體內(nèi)可能產(chǎn)生ATA，可能降低ADC療效，故需在開發(fā)中對其進行評估。

圖2. 抗體偶聯(lián)藥物的待測物類型。（Kaur, S. 等，2013）

DAR分析

DAR分析包含兩個層面：

1. 平均DAR：系統(tǒng)中毒素分子與抗體分子的摩爾濃度比；

2. DAR分布：不同DAR值的ADC在總ADC中的占比。  

常用方法：光譜法、高效液相色譜-紫外法（HPLC-UV）與質(zhì)譜法。

藥代動力學(xué)分析方法

?總抗體的測定

• 間接ELISA：使用包被抗原捕獲總抗體，再根據(jù)抗體種屬屬性選擇二抗作為檢測抗體?。優(yōu)點：應(yīng)用廣、技術(shù)成熟；缺點：有時難以獲得商用抗原。

• 電化學(xué)發(fā)光法（ECLA）：采用更高靈敏度、更寬動態(tài)范圍的電化學(xué)發(fā)光技術(shù)（如Meso Scale Diagnostics公司的MSD儀器）。

?偶聯(lián)抗體的測定

偶聯(lián)抗體指結(jié)合小分子藥物且DAR ≥ 1的抗體，多采用ELISA檢測。

• 橋連ELISA：基于生物素與親和素/鏈霉親和素結(jié)合的高特異性和信號放大效應(yīng)（一分子親和素可結(jié)合四分子生物素）設(shè)計，用于放大檢測信號。

?結(jié)合型小分子藥物的測定

通常先將ADC與游離小分子毒素分離，再通過化學(xué)反應(yīng)或酶解釋放小分子毒素，最終通過ELISA或LC-MS/MS準確定量。

• ELISA：選用抗獨特型抗體、抗原胞外區(qū)（ECD）或抗人IgG抗體捕獲ADC的抗體部分，以抗小分子藥物抗體作為檢測試劑。

• LC-MS/MS：先用試劑（如蛋白A、抗獨特型抗體、抗原等）捕獲偶聯(lián)抗體，去除連接臂后，對小分子藥物進行LC-MS/MS分析。

?游離小分子藥物的測定

指已從抗體上解離的藥物部分，可采用競爭ELISA?與LC-MS/MS?檢測。

• 競爭ELISA（以游離DM1檢測為例）：樣品經(jīng)乙腈沉淀后，含游離DM1的上清與生物素化小鼠抗DM1抗體混合，轉(zhuǎn)移至包被BSA-DM1的酶標板。樣品中DM1會與包被BSA-DM1競爭性結(jié)合抗DM1抗體——樣品中DM1濃度越高，BSA-DM1結(jié)合的抗DM1抗體越少，鏈霉親和素-HRP檢測的信號越低。

ATA分析

ADC的ATA結(jié)合表位可能是其三個組分（抗體、連接子、藥物）之一或其組合。ATA通常采用配體結(jié)合分析（LBA），捕獲試劑通常為固相ADC，理論上可捕獲靶向不同表位的所有ATA。分析一般分為兩步：

1. 篩選分析：初步檢測ATA；

2. 確證分析：驗證免疫應(yīng)答的特異性。  

可使用的技術(shù)包括ELISA、橋連ELISA、ECLA、放射免疫沉淀法（RIP）、表面等離子共振（SPR）等，各方法均有優(yōu)缺點。

治療性單抗藥物監(jiān)測

Creative Diagnostics提供符合ISO 13485質(zhì)量管理體系開發(fā)的32種生物藥監(jiān)測ELISA試劑盒，由專家科學(xué)家按CLSI與FDA指南進行質(zhì)控。

參考文獻

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